1. Introduction
2. Materials and Methods
2.1. 공시균주
2.2. 배지 및 시료
2.3. 오존 발생 및 처리
2.4. 병원성균에 대한 오존의 살균 효과
2.5. 달걀에 대한 오존 처리
2.6. 통계분석
3. Resulta and Discussion
4. Conclusions
1. Introduction
오존(O3)은 세 개의 산소 원자가 결합한 산소의 동소체로, 특유의 자극적인 냄새와 강력한 산화력을 가진 분자이다. 오존은 불안정한 구조로 인해 쉽게 분해되며, 이 과정에서 다양한 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 형성한다. 이러한 특성은 오존을 대기 정화뿐만 아니라 미생물 억제와 같은 다양한 응용 분야에서 활용할 수 있는 기반이 된다[1]. 자연계에서 오존은 주로 성층권의 오존층에 존재하며, 자외선에 의한 광분해 과정에서 생성과 분해가 동적 평형을 이루고 있다. 상업적으로는 코로나 방전(corona discharge)과 자외선 조사(UV photolysis) 기술이 오존 발생의 주요 원리로 이용되고 있다[2,3]. 오존의 항균 작용은 여러 기작에 의해 설명된다. 첫째, 단백질, 효소, 펩타이드의 -SH기를 산화시켜 구조적 변성과 기능 상실을 유도한다. 둘째, 고도불포화지방산을 산화하여 과산화물을 형성함으로써 세포막 손상을 초래한다[4]. 또한 오존은 세포막을 투과하여 DNA 손상과 효소계 교란을 유발함으로써 세균과 바이러스의 불활성화를 일으킨다[5,6]. 수중에서 오존은 빠르게 분해되어 초과산화물 라디칼(O2–), 하이드록실 라디칼(–OH), 과산화수소(H2O2) 등 다양한 ROS를 생성하며, 이들 역시 단백질과 지질 등 생체 고분자에 손상을 주어 항균 작용을 강화한다. 이러한 반응성은 오존의 독특한 전자 배열에서 기인하며, 반감기가 짧아 주로 식품 표면에서 강력한 살균 효과를 발휘한다[7]. 이러한 특성으로 인해 오존은 식품 분야에서 기존 소독제를 대체할 수 있는 유망한 기술로 부각되고 있다. 오존은 –2.07 V의 높은 산화환원 전위를 바탕으로 염소보다 약 1.5배 강력한 살균력을 지니며, 대장균(Escherichia coli), Listeria spp.와 같은 주요 식품 매개 병원성 미생물을 신속히 억제할 수 있다[8,9]. 또한 오존은 사용 후 빠르게 산소로 분해되어 잔류 독성이 없으며, 화학적 부산물을 거의 생성하지 않기 때문에 환경 친화적이다. 더불어 현장에서 필요 시 즉시 생성이 가능하고, 운송이나 저장 과정이 필요하지 않으며, 비교적 낮은 에너지 소모로 운영할 수 있다는 장점이 있다[10]. 최근 연구에서는 오존 처리가 식품의 품질 특성을 크게 저해하지 않으면서 저장 수명을 연장할 수 있음이 보고되었으며[11,12], 세척수 재활용, 표면 소독, 악취 제거, 숙성 억제 등 다양한 응용 사례도 제시되고 있다[13]. 따라서 오존은 강력한 항균력에 기반하여 식품 안전성을 향상시키고, 환경 부담을 줄이며, 경제적 이점을 제공하는 지속 가능한 기술로 평가된다. 이러한 배경은 식품 산업에서 오존을 활용한 소독 및 보존 기술의 가능성을 탐구하는 연구가 활발히 진행되는 근거가 된다. 이에 본 연구에서는 오존의 발생 원리와 항균 기작을 고찰하고, 식품 산업적 응용 가능성과 장점을 분석함으로써 오존 처리가 안전하고 효과적인 식품 위생 관리 기술로 활용될 수 있는 기반을 마련하고자 하였다.
2. Materials and Methods
2.1. 공시균주
본 시험에 사용된 병원성 균주는 Escherichia coli KCCM 11591, Salmonella Enteritidis 11702, Enterococcus faecalis HKWS 804, Staphylococcus epidermidis HKWS 901이다. Escherichia coli 11591은 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Collection of Microorganism, Seoul, Korea)에서, Salmonella Enteritidis 11702는 국가병원체자원은행 (National Culture Collection for Pathogens, Cheongju, Korea)에서 구입하였다. Enterococcus faecalis HKWS 804와 Staphylococcus epidermidis HKWS 901은 한경국립대학교(Anseong, Korea) 낙농식품연구실에서 채소류로부터 분리·동정한 것을 이용하였다.
2.2. 배지 및 시료
병원성 미생물의 생장은 LB agar(Difco, CA, USA)를 사용하여 확인하였다. 각 균주를 도말한 후 오존 비처리구(대조구)와 시간대별 오존 처리구로 구분하여 37°C에서 24 h 배양한 뒤 콜로니 형성 여부를 조사하였다. 또한 시중에서 구입한 달걀을 대상으로 오존 처리에 따른 미생물 수를 측정하였다. 달걀 표면에서 채취한 시료는 total plate count agar(Difco, CA, USA)를 이용하여 배양 후 계수하였다.
2.3. 오존 발생 및 처리
오존 발생은 ㈜푸른빛(Siheung, Korea)에서 제작한 플라즈마 발생 장치를 이용하였다. 본 장치는 내부에 플라즈마 시스템을 갖추고 있으며, 크기는 40 × 30 × 45 cm(0.054 CBM)이다(Fig. 1). 플라즈마 장치는 총 60 min 동안 가동하였으며, 오존 농도는 10 min 간격으로 측정하였다. 오존 발생량과 살균지속 시간은 Table 1에 제시하였다. 구체적으로, Group 1–4는 오존발생 30 min, 살균유지 시간을 0–30 min으로 설정하고, 이후 15 min간 탈취과정을 거쳤다. Group 5–8은 오존을 60 min 동안 발생시킨 후 살균유지 시간을 0–30 min으로 설정하고 마찬가지로 15 min간 탈취 과정을 수행하였다.
2.4. 병원성균에 대한 오존의 살균 효과
병원성 미생물은 사전 배양하였으며, 균수는 약 10⁹ CFU 수준이었다. 각 병원성 미생물 배양액 100 µL를 LB agar에 도말한 후, Table 1에 제시된 조건에 따라 대조구(비처리구)와 처리구로 나누어 실험을 수행하였다. 이후 37°C 배양기에서 24 h동안 배양하였으며, 대조구와 오존 처리구의 콜로니 생성 여부를 확인하였다.
2.5. 달걀에 대한 오존 처리
달걀 표면 살균 효과는 안성시 소재 하나로마트에서 구입한 달걀을 대상으로 시험하였다. 구입 직후 달걀을 오존비처리구(대조구)와 오존 처리구로 나누고, 각각 달걀 표면으로부터 가로·세로 1 cm 구역에서 멸균 면봉을 이용하여 균을 채취하였다. 채취된 멸균 면봉은 멸균된 0.1% peptone(Difco, CA, USA)수 9 mL에 넣어 균질화하였다. 이후 균질액에서 100 µL를 취하여 표준평판배양법을 실시하였으며, SPC agar에 도말한 후 37°C 배양기에서 24 h 배양하여 형성된 콜로니를 계수하였다.
2.6. 통계분석
모든 실험은 3회 반복하여 수행하였으며, 결과는 평균값과 표준편차(mean ± standard deviation, SD)로 나타내었다. 처리 간 유의성 검정은 일원분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며, p < 0.05 수준에서 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다. 통계 분석은 Microsoft Excel (Office 365, Microsoft Corp., Redmond, WA, USA)을 이용하여 수행하였다.
3. Resulta and Discussion
기기의 작동 시간에 따른 오존 발생량은 Fig. 2에 나타낸 바와 같이, 10 min에 86.5 ppm, 20 min에 145.7 ppm, 30 min에 181.3 ppm, 40 min에 203.4 ppm, 50 min에 215.5 ppm, 60 min에 224.3 ppm으로 시간에 비례하여 증가하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 플라즈마 장치의 작동 시간이 길어짐에 따라 오존 발생량이 지속적으로 누적되며, 최대 농도에 도달할 때까지 일정한 상승 패턴을 나타낸다는 점을 확인시켜 준다. 기기 작동 30 min 동안의 오존 발생량과 병원성 미생물의 사멸 효과 간의 관계를 규명하기 위하여 Table 1의 Group 1–4 조건에 따라 실험을 수행하였으며, 잔존 오존 농도는 Fig. 3에 제시하였다. 30 min 동안의 오존 발생 후 살균 유지 시간을 달리한 결과, E. coli, Ent. faecalis, Staph. epidermidis는 유지 시간이 길어질수록 사멸 효과가 점진적으로 증가하였으나, 최종적으로 완전한 사멸에는 도달하지 못하였다(Fig. 4-A, B, C). 이는 오존이 강력한 산화력을 지님에도 불구하고 특정 미생물의 세포벽 구조나 내성 특성에 따라 사멸 속도가 달라질 수 있음을 시사한다. 반면, Sal. Enteritidis의 경우 살균 유지 10 min에서부터 현저한 감소를 보였으며, 20 min 이후에는 완전한 사멸이 관찰되었다(Fig. 4-D). 이러한 결과는 균종별로 오존 감수성에 차이가 존재함을 보여주며, 특히 Salmonella 속이 다른 균주보다 상대적으로 민감하게 반응함을 나타낸다.
Table 1.
Conditions of ozone generation, sterilization retention, and deodorization time. The table summarizes the experimental settings for each group, including the duration of ozone generation, retention period for sterilization, and the subsequent deodorization step
Fig. 4
Bactericidal effects of ozone against pathogenic microorganisms after 30 min of generation with different retention times. A; Escherchiacoli KCCM 11591, B; Enterococcusfaecalis HKWS 804, C; Staphylococcusepidermidis HKWS 901, D; Salmonella Enteritidis 11702, a; Control (non-ozone treatment), b; 30 min/0 min/15 min, c; 30 min/10 min/15 min, d; 30 min/20 min/15 min, e; 30 min/30 min/15 min for ozone generation time/sterilization retention time/deodorization time.
완전한 사멸 조건을 규명하기 위하여 Fig. 5의 조건으로 기기를 60 min간 작동시켜 약 224 ppm의 오존을 확보한 뒤, 살균 유지 시간을 0–30 min으로 설정하여 병원성 미생물에 대한 살균 효과를 확인하였다(Fig. 6). 그 결과, 모든 병원성 미생물이 살균 유지 시간이 0 min 이상일 때부터 완전히 사멸되는 것으로 나타났다. 이는 일정 농도의 오존이 확보되면, 유지 시간과 관계없이 즉각적인 살균 효과가 발휘될 수 있음을 의미한다.
또한 식품 적용 가능성을 검토하기 위해 달걀 표면을 대상으로 동일 조건(224.3 ppm, 살균 유지 0 min)에서 시험한 결과, 일정 수준의 미생물 감소가 확인되었다(Fig. 7). 이는 오존 처리가 실제 식품 표면에서도 항균 효과를 발휘할 수 있음을 보여준다. 그러나 대조구의 초기 오염도가 매우 낮았기 때문에 처리 효과를 명확하게 검증하기에는 다소 한계가 있었다. 따라서 향후 연구에서는 초기 미생물 오염도가 높은 조건이나 인위적 접종 실험을 통해, 오존 처리가 식품 표면에서 나타내는 실제 살균 효과를 보다 명확하게 규명할 필요가 있다. 본 연구의 결과는 상온상압 플라즈마 살균기를 이용한 오존 처리가 병원성 미생물에 대해 강력한 살균 효과를 나타냄을 보여준다. 특히 60 min간의 발생으로 224 ppm 이상의 오존 농도를 확보할 경우, 짧은 유지 시간에도 완전한 사멸이 가능하였다. 반면, 215 ppm 수준에서는 일부 균주가 생존하여, 미생물의 종류에 따라 오존에 대한 감수성이 다르게 나타남을 알 수 있었다. 이는 세포벽 구조적 차이에 의해 오존의 작용 속도와 효과가 달라질 수 있음을 시사한다. 선행 연구들에서도 오존은 그람음성균, 그람양성균, 효모, 곰팡이, 바이러스 등 다양한 미생물에 대해 광범위한 억제 효과를 보이는 것으로 보고되었다[1]. 특히 E. coli, Salmonella spp.와 같은 그람음성 세균은 세포벽 구조 특성상 오존에 대한 감수성이 높아 본 연구와 일치하는 결과가 확인되었다[14,15]. 반면, 포자 형성균(Bacillus spp.)이나 일부 곰팡이는 상대적으로 저항성이 강하여 더 높은 농도나 긴 처리 시간이 요구된다[12]. 오존의 항균 효과는 세포막 불포화지방산의 산화, 단백질 및 효소의 -SH기 산화, 핵산 손상 등 다양한 기작을 통해 발휘된다[16,17]. 이러한 다중 표적 작용은 염소와 같은 전통적 소독제와 구별되는 특성으로, 염소가 주로 효소에 작용하는 것과 달리 오존은 세포벽과 세포 내 성분을 동시에 손상시켜 신속하고 비선택적인 불활성화를 유도한다[18]. 유제품을 포함한 식품 분야에서 오존 처리는 다양한 긍정적 결과가 보고되었다. 예를 들어, Sheelamary와 Muthukumar[19]는 원유에서 Listeria monocytogenes를 완전히 제거하였다고 보고하였다. Cavalcante 등 [20]은 Enterobacteriaceae 및 곰팡이 수 감소를 보고했으며, Torlak과 Sert[21]는 분유에서 Cronobacter sakazakii를 효과적으로 제어하였다. 이러한 결과는 오존 처리가 열처리에 비해 품질 손상을 최소화하면서도 위생적 안전성을 높일 수 있음을 시사한다. 또한 오존은 기체 및 수용액 두 형태로 적용 가능하며, 각각 장단점이 존재한다. 기체상 오존은 확산성이 높아 설비의 사각지대나 바이오필름 제어에 유리하고[22], 수용액상 오존은 즉각적인 살균 효과가 있으나 반감기가 짧아 지속성이 떨어진다. 실제로 오존은 Pseudomonas spp. 바이오필름 억제에도 효과적인 것으로 보고되었다[23,24]. 더 나아가 오존은 마이코톡신과 같은 독성 대사산물의 생물학적 활성을 억제하는 해독 효과도 보고되어[10], 식품 안전성 향상에 기여할 수 있다. 그러나 오존 처리에는 한계와 주의점도 존재한다. 고농도 오존은 기계 및 배관 재질에 부식을 유발할 수 있으며, 인체에 노출될 경우 두통이나 점막 자극, 심각한 건강 피해를 초래할 수 있다[12]. 따라서 산업 현장 적용 시에는 오존 감지 장치와 안전 시스템이 필수적이다[25,26]. 또한 오존은 식품 내부로 깊게 침투하지 못해 표면 위주의 살균에 국한될 수 있으며, 농도와 처리 조건에 따라 풍미, 색, 질감 등 품질 특성에 영향을 줄 가능성도 있다[20,27]. 흥미롭게도 오존은 항생제와 독소 저감에도 효과가 있어, Alsager 등[28]은 우유 내 항생제의 95% 이상이 분해됨을 확인하였고, Liu 등[29]은 저온살균 우유에서 항생제 잔류량을 허용 기준 이내로 낮추었다. 또한 아플라톡신 저감에도 효과적이며[30,31], 이는 단순한 살균제를 넘어 식품 안전성 전반에 기여할 수 있음을 시사한다.
Fig. 6
Bactericidal effects of ozone against pathogenic microorganisms after 60 min of generation with different retention times. All pathogens were completely inactivated even at short retention times, although E. faecalis survival was observed at lower concentrations. A; Escherchia coli KCCM 11591, B; Enterococcus faecalis HKWS 804, C; Staphylococcus epidermidis HKWS 901, D; Salmonella Enteritidis 11702, a; Control (non-ozone treatment), b; 60 min/0 min/15 min, c; 60 min/10 min/15 min, d; 60 min/20 min/15 min, e; 60 min/30 min/15 min for ozone generation time/sterilization retention time/deodorization time.
Fig. 7
Bactericidal effects of ozone on microorganisms on the egg surface after 60 min of ozone generation. Eggs treated with ozone at 224 ppm showed microbial reduction on the shell surface, although the low initial contamination level limited the verification of treatment efficacy. A; Control (non-ozone treatment), B; After 60 min of ozone treatment, Arrows indicate colonies.
결론적으로, 오존 처리는 다양한 병원성 미생물에 효과적이며, 유제품 및 식품 산업에서 열처리를 보완하거나 대체할 수 있는 잠재력을 지닌 기술이다. 그러나 적용 시 안전 관리 체계 구축, 장비 재질 검토, 품질 영향 평가, 최적 처리 조건 확립이 병행되어야 하며, 장기적 품질 안정성과 소비자 수용성을 고려한 추가 연구가 요구된다.
4. Conclusions
상온상압 플라즈마 살균기의 작동 시간에 따라 오존 발생량은 선형적으로 증가하여 60 min에서 약 224 ppm에 도달하였다. 오존 발생 30 min 조건에서 병원성 미생물의 사멸 효과를 평가한 결과, E. coli, Ent. faecalis, Staph. epidermidis는 처리 시간이 늘어날수록 사멸 효과가 증가했으나 완전한 사멸에는 이르지 못하였다. 반면, Sal. Enteritidis는 살균 시간 20 min 유지 시 완전히 사멸되었다. 60 min간 오존을 발생시킨 조건에서는 모든 병원성 미생물이 짧은 유지 시간에서도 완전히 사멸되었으나, 50 min 조건(215 ppm)에서는 일부 균주가 생존하였다. 이는 미생물별 세포벽 구조 차이가 감수성 차이를 유발함을 시사한다. 또한 식품 적용 가능성을 확인하기 위해 달걀 표면에 처리한 결과 일정 수준의 사멸 효과가 있었으나, 초기 오염도가 낮아 추가 검증이 필요하였다. 선행 연구와 비교했을 때, 오존은 세균, 효모, 곰팡이, 바이러스 등 다양한 미생물에 대해 광범위한 억제 효과를 가지며, 열처리에 비해 품질 손상을 줄이면서도 위생 안전성을 향상시킬 수 있는 비열적 공정임이 확인되었다. 다만, 기계 부식, 인체 안전성, 품질 변화 가능성과 같은 한계가 있어, 산업 적용 시 안전 관리 및 최적 조건 설정이 요구된다. 종합적으로 오존 처리는 식품 산업에서 병원성 미생물 제어에 효과적이고, 잔류물이 없는 살균 방법으로 활용될 수 있는 잠재력을 지니고 있으나, 대규모 적용을 위한 추가 연구가 필요하다.
