1. Introduction
2. Materials and Methods
2.1. 정액 채취
2.2. 시료 준비 및 처리
2.3. 생존율 검사
2.4. 첨체반응률 검사
2.5. 통계분석
3. Results and Discussion
4. Conclusion
1. Introduction
인공수정(artificial insemination, AI)은 우수한 유전자원을 효율적으로 활용하고 가축의 번식 효율을 향상시키는 대표적인 보조생식기술로서, 소와 돼지를 비롯한 주요 가축산업에서 널리 활용되고 있다[1]. 이러한 인공수정의 효율은 정액 보존 기술에 크게 의존하며, 정액 보존은 크게 동결보존과 액상보존으로 구분된다. 동결보존은 장기간 보존이 가능하다는 장점이 있으나, 동결·융해 과정에서 발생하는 저온충격과 삼투압 변화로 인해 정자막이 손상되어 생존율과 수정능력이 저하될 수 있다[2]. 반면 액상보존은 정자를 동결하지 않고 보존하는 방법으로, 동결·융해로 발생하는 물리적 손상 없이 인공수정을 위한 실용적 대안으로 활용되고 있다[3]. 그러나 액상보존 역시 저장 기간이 경과함에 따라 정자의 운동성, 생존율 및 수정능력 등 정자의 품질이 점진적으로 감소하는 한계를 가지므로[4,5], 정자의 기능을 최대한 유지할 수 있는 보존 조건의 확립이 요구된다. 특히 염소 정자는 다른 반추동물과 마찬가지로 원형질막 내 polyunsaturated fatty acids (PUFAs)의 함량이 높아 환경적 스트레스와 산화적 손상에 민감하며[6], 이러한 특성은 액상보존 과정에서 정자막의 안정성과 기능을 더욱 저하시킬 수 있다. 따라서 액상보존 중 정자의 기능 저하를 최소화하기 위해서는 희석액 조성, 정장물질 제거 여부 및 저장 온도와 같은 보존 조건을 최적화하는 것이 중요하지만, 이들 요인이 염소 정자의 액상보존 과정에서 미치는 영향은 아직 충분히 규명되지 않았다.
정액 희석액의 일차적 목적은 물리적 손상을 방지하고 삼투압 균형과 pH를 조절하는 생화학적 환경을 유지하는 데 있다[7]. 정액 보존액으로 많이 사용되는 Modena B와 Triladyl은 모두 동일한 완충 시스템을 기본으로 하나, 정자막을 보호하는 지질 성분의 구성에서 뚜렷한 차이를 보인다. Modena B는 화학적으로 정의된 희석액으로, 돼지 정액의 액상보존을 위해 널리 사용되고 있고, Triladyl은 난황을 함유한 상업용 희석액으로 소 정액의 동결보존에서 표준으로 자리잡아 양, 소 등 다양한 축종의 정액 보존에도 널리 활용되고 있다[8]. 이처럼 두 희석액은 액상보존을 위한 지질 보호 전략이 서로 다르므로, 염소 정자의 액상보존에서도 서로 다른 생리학적 반응을 나타낼 가능성이 있다. 난황 유래 지질 성분은 냉각 과정에서 발생하는 저온충격을 완화하는 것으로 알려져 있어[9,10], 저온충격의 위험이 큰 조건에서는 오히려 유리하게 작용할 수 있는 반면, 화학적으로 정의된 희석액은 난황 유래 성분을 포함한 희석액보다 미생물 오염이나 성분 변성이 적게 나타난다[11]. 두 희석액은 다양한 가축 종에서 사용되어 왔으나 염소에서의 상대적 적합성은 명확히 밝혀지지 않아 연구가 필요한 실정이다. 또한, 정장물질과의 반응성에서도 서로 다른 양상을 보일 수 있어 염소 정자의 액상보존 전략을 결정하는 데 핵심적인 요인으로 작용할 것으로 판단된다.
액상보존 과정에서 정장물질이 정자 기능에 미치는 영향은 소, 돼지, 양 등 여러 가축에서 보고되어 왔다[12]. 특히 염소에서는 정장물질에 함유된 phospholipase A₂가 난황 기반 희석액의 인지질을 분해하여 lysophospholipid와 유리지방산을 생성하는 종 특이적 반응이 알려져 있다[13,14]. 이러한 반응은 정자 원형질막의 구조적 안정성을 저하시켜 첨체 손상 및 생존율 감소를 유발하는 것으로 보고되어 있으며[15], 이러한 배경에서 정장물질을 제거하여 액상보존 중 정자 기능을 유지하려는 연구가 지속적으로 이루어져 왔다. 실제로 정장물질 제거가 조기 첨체반응을 감소시키고 정자 기능을 향상시킨다는 보고도 확인된다[16]. 그러나 이러한 반응은 모든 희석액 조건에서 동일하게 나타나는 것이 아니라 난황과 같은 특정 지질 성분이 존재할 때 두드러진다는 점에서[17], 정장물질의 영향은 희석액 조성에 따라 달라질 가능성을 시사한다. 또한 이러한 반응은 저장 환경에 의해서도 영향을 받을 수 있으므로, 정장물질 제거의 효과 역시 저장 온도에 따라 달라질 가능성이 있다. 그러나 희석액 조성과 저장 온도를 함께 고려하여 이러한 상호작용을 평가한 연구는 아직 제한적인 실정이다.
저장 온도는 액상보존 중 정자의 생존성과 기능 유지를 결정하는 중요한 요인이다. 일반적으로 저온에서는 정자의 막 지질의 변화로 인해 막의 구조적 안정성이 저하되는 저온충격이 유발될 수 있으며, 이러한 현상은 특히 저온에 민감한 축종에서 정자의 생존 능력과 수정능력을 저하시킬 수 있다[18]. 이러한 저온충격에 대한 민감도는 정자막의 지질 조성에 의해 크게 좌우되며, 특히 콜레스테롤 대 인지질 비율이 낮은 돼지와 염소의 정자는 저온충격에 취약한 것으로 알려져 있다[19,20]. 이에 따라 가축 정액의 액상보존에서는 일반적으로 4°C와 17°C가 축종에 따라 대표적인 저장 온도로 활용되어 왔다[21,22,23]. 4°C는 정자의 대사를 효과적으로 억제하여 보존 기간을 연장할 수 있는 반면 저온충격의 위험이 존재한다[24]. 반면 17°C는 저온충격의 위험은 상대적으로 낮지만, 대사활성이 4°C보다 높게 유지되므로 장기 저장 과정에서 정자 기능 유지에 차이가 나타날 가능성이 있다[25]. 그러나 염소에서는 저장 온도가 정자 기능에 미치는 영향에 대한 평가는 아직 제한적인 실정이다.
희석액 조성, 정장물질의 존재 여부, 그리고 저장 온도는 액상보존 중 염소 정자의 생화학적 환경과 막 안정성에 영향을 미치는 요인이다. 그러나 이 세 요인의 조합에 따른 상호작용 효과를 함께 검토한 연구는 아직 부족한 실정이다. 이에 본 연구는 이러한 세 요인이 액상보존 중 염소 정자의 기능 유지에 각각 영향을 미칠 뿐만 아니라, 서로 상호작용함에 따라 정자 기능의 유지 양상이 달라질 것이라는 가설을 설정하고, 이를 검증하고자 하였다. 이를 위해 정자를 최대 120시간까지 보존하면서 0, 72, 및 120시간에 유세포분석을 통해 생존율과 첨체반응률을 평가함으로써, 온도, 희석액, 정장물질 세 요인이 정자 기능에 미치는 영향에 대한 기초 자료를 제공하고자 하였다.
2. Materials and Methods
2.1. 정액 채취
본 연구에서는 강원대학교 목장에서 사육되는 4마리의 염소(10.2 ± 2.5 월령)로부터 전기자극기(Lane Manufacturing. Inc, Denver, CO, USA)를 이용하여 각 개체당 1회씩 정액을 채취하여 총 4개의 생물학적 반복(n = 4)으로 실험을 진행하였다. 채취된 정액 중 70% 이상의 운동성을 보이는 정액을 선정하여 실험에 사용하였다. 본 연구의 모든 실험 절차는 강원대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 수행되었다(KNU-KW-250714-1).
2.2. 시료 준비 및 처리
채취된 정액은 정장물질 유무, 희석액 종류 및 저장 온도의 조합에 따라 처리되었다. 모든 처리 과정은 약 37.5°C에서 수행되었다. 희석액은 modified-Modena B (M; glucose 30.0 g/L, EDTA 2.25 g/L, sodium citrate 6.90 g/L, sodium bicarbonate 1.00 g/L, Tris 5.00 g/L, citric acid 2.50 g/L, cysteine 0.05 g/L, gentamicin sulfate 0.30 g/L)와, 20% 난황을 함유한 Triladyl (Tr; Minitube, Tiefenbach, Bavaria, Germany) 두 종류를 사용하였다. 정장물질을 제거한 시료(NS)는 정장제거액(glucose 10.54 mM, sodium chloride 130 mM, potassium chloride 5.1 mM, potassium phosphate monobasic 1.19 mM, sodium phosphate dibasic 9.86 mM, magnesium sulfate heptahydrate 1.47 mM, calcium chloride dihydrate 0.93 mM; pH 7.4; 290 mOsm)에 혼합하여 총 1 mL로 희석한 뒤, 1,800 rpm에서 5분 동안 원심분리 후 상층액을 제거하고 각 희석액에 최종 농도 1 × 108 sperm/mL이 되도록 재현탁하였다. 정장물질을 제거하지 않은 시료(S)는 원심분리 과정 없이 채취된 정액을 그대로 각 희석액에 동일한 최종 농도(1 × 108 sperm/mL)로 직접 희석하였다. 이 두 요인을 조합하여 NS M, S M, NS Tr, S Tr의 4개 처리구를 구성하였고, 이를 각각 4°C와 17°C에서 보존하여 총 8개 처리구로 실험을 설계하였다. 희석된 정액은 각 저장 온도를 유지한 상태로 실험실로 운반하였으며, 유세포분석을 위해 최종 농도를 1.0 × 107개/mL로 조정하였다. 정자의 생존율 및 첨체반응률은 보존 0, 72 및 120시간 후에 유세포분석기(Attune NxT CytPix, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 평가하였다.
2.3. 생존율 검사
정자 생존율 검사를 위하여 SYBR-14 (Thermo Fisher Scientific)와 propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 이중염색을 사용하였다. 시료는 1.0 nM SYBR-14와 2.4 µM PI를 이용하여 15분간 38.5°C 암실 조건에서 배양되었다. 염색 후 정자는 1,800 rpm에서 5분 동안 원심분리 후 1.0 mL phosphate-buffered saline (PBS)에 재현탁한 후, 유세포분석기를 이용하여 10,000개의 정자를 분석하였다. 검출된 정자는 원형질막 손상 유무에 따라 SYBR-14가 염색된 정자는 살아있는 정자로, PI가 염색된 정자는 사멸한 정자로 분류하여 살아있는 정자의 비율을 생존율로 산출하였다.
2.4. 첨체반응률 검사
정자 첨체반응률 검사를 위하여 fluorescein isothiocyanate-conjugated peanut agglutinin (FITC-PNA; Sigma-Aldrich)와 PI의 이중염색을 사용하였다. 정자는 0.02 µg/mL FITC-PNA와 2.4 µM PI를 이용하여 15분간 38.5°C 암실 조건에서 배양되었다. 배양 후 정자는 1,800 rpm에서 5분 동안 원심분리 후 1.0 mL PBS로 재현탁한 후, 유세포분석기를 이용하여 10,000개의 정자를 분석하였다. 검출된 정자 중 FITC-PNA가 염색된 정자는 첨체반응이 일어난 정자로, PI가 염색된 정자는 사멸한 정자로 분류하여, 첨체반응이 일어난 정자의 비율을 첨체반응률로 산출하였다.
2.5. 통계분석
통계분석은 GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 정자의 생존율 및 첨체반응률 데이터에서 동일 처리구 내 온도 간 차이는 Student's t-test를 통해, 동일 온도 내 정장물질과 희석액에 따른 영향은 one-way ANOVA를 통해 p < 0.05 수준에서 유의차를 검정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로 표시하였다.
3. Results and Discussion
염소 정자의 생존율은 희석액 종류와 저장 온도 및 정장물질 유무에 따른 영향을 확인하기 위해 0, 72 및 120시간에 평가하였다(Fig. 1). 72시간, 17°C 저장 조건(Fig. 1C)에서 NS M (38.15 ± 4.18%)과 S M (39.50 ± 7.59%) 처리구는 NS Tr (11.02 ± 1.43%), S Tr (12.91 ± 6.15%) 처리구보다 유의적으로 높은 생존율을 나타냈으며(p < 0.05), 120시간(Fig. 1D)에는 S M (26.76 ± 5.26%) 처리구가 S Tr (9.35 ± 3.06%) 처리구보다 유의적으로 높은 생존율을 유지하였다(p < 0.05). 정자 원형질막은 저온에서 불안정화되어 구조적 안정성이 저하되는데, 17°C는 이러한 저온충격(cold shock)으로 인한 손상을 완화하여 정자막의 안정성을 유지시킨다고 알려져 있다[24]. 본 연구에서 Modena B 처리구는 저장 기간 전반에 걸쳐 17°C에서 4°C보다 높은 생존율을 나타냈다. 이는 Modena B가 저장 과정에서 정자 원형질막의 안정성이 비교적 안정적으로 유지된 것으로 판단된다. 반면 Triladyl 처리구에서는 이러한 경향이 나타나지 않았으며, 특히 17°C 저장 72시간까지 생존율이 급격히 감소하였다. 이는 저장온도 자체의 영향만으로 설명되기보다 난황 기반 희석액과 염소 정장물질 간의 상호작용이 함께 작용한 결과로 판단된다. 염소 정장물질에는 지질분해효소가 존재하여 난황의 lecithin을 가수 분해하고 세포독성을 나타내는 lysolecithin (lysophosphatidylcholine)을 생성하는 것으로 알려져 있으며[14], 염소 정장액과 Triladyl 난황 희석액을 혼합하였을 때 응고 현상과 함께 정자의 급격한 생존율 저하가 나타났다는 보고도 존재한다[26,27]. 또한 이러한 효소가 난황뿐 아니라 우유 기반 희석액에서도 유사한 손상을 유발할 수 있음을 보고하였다[27]. 선행연구를 종합하면, 본 연구에서 관찰된 Triladyl 처리구의 저장 초기 생존율 감소는 난황 기반 희석액과 염소 정장물질 간의 상호작용으로 인해 정자 원형질막 안정성이 저하된 결과로 판단된다. 이러한 결과는 저장온도의 효과를 희석액 조성과 분리하여 해석하기 어려움을 시사한다.
Fig. 1
Sperm viability of goat semen diluted with Modena B or Triladyl, with or without seminal plasma, during liquid storage at 4°C or 17°C. Representative flow cytometric dot plots of sperm stained with SYBR-14 and propidium iodide (PI) at 0, 72, and 120 hours of storage (A). Sperm viability at 0 hour (B), 72 hours (C), and 120 hours (D) of storage. Data are presented as mean ± SEM (n = 4). Statistical analyses were performed separately at each time point using one-way ANOVA and Student's t-test. a,b Different lowercase letters indicate significant differences among extender/seminal plasma groups within the same storage temperature (p < 0.05). NS: without seminal plasma, S: with seminal plasma, M: Modena B, and Tr: Triladyl.
염소 정자의 첨체반응률은 희석액 종류와 저장 온도 및 정장물질 유무에 따른 영향을 평가하기 위해 0, 72 및 120시간에 분석하였다(Fig. 2). 저장 초기의 생존율 감소와 함께 첨체반응률의 증가가 관찰되었다. 보존 72시간 시점(Fig. 2C)에 NS Tr 처리구는 17°C(44.14 ± 4.82%) 조건이 4°C(15.84 ± 4.78%) 조건보다 유의적으로 높은 첨체반응률을 나타냈으며(p < 0.05), 17°C 저장 조건에서 NS Tr (44.14 ± 4.82%와 52.84 ± 4.85%)과 S Tr (48.74 ± 7.90%와 63.72 ± 9.70%) 처리구의 첨체반응률은 72시간과 120시간 모두에서 NS M (8.35 ± 2.18%와 17.98 ± 3.71%)과 S M (9.46 ± 2.83%와 14.88 ± 3.62%) 처리구보다 유의적으로 높았다(p < 0.05, Fig. 2C-2D). 반면 Modena B 처리구에서는 Triladyl 처리구와 같은 급격한 첨체반응률의 증가가 관찰되지 않아, 저장 과정에서 첨체 안정성이 비교적 잘 유지된 것으로 판단된다. 정자 원형질막이 lysolecithin에 의해 손상되면 정자 두부의 이중막 구조가 불안정해져 첨체반응이 쉽게 유도되는 것으로 알려져 있는데[28,29], 본 연구에서도 Triladyl 처리구의 생존율 감소와 첨체반응률 증가는 모두 저장 72시간 전후에서(Fig. 2B-2D) 관찰되어 두 현상이 공통된 막 손상 과정과 관련되어 있을 수 있다. 또한 120시간 시점(Fig. 2D)에서 S Tr 처리구의 첨체반응률은 NS Tr 처리구보다 높은 경향이 나타나 저장 과정에서 정장물질의 지속적인 존재가 이러한 손상을 더욱 심화시키는 요인으로 작용했을 가능성을 시사하였다. 조기 첨체반응은 난자와 접촉하기 이전에 수정능을 상실하게 만드는 주요 원인으로 알려져 있으므로[30,31], Triladyl 처리구에서 관찰된 높은 첨체반응률은 액상보존 중 수정능 유지에도 불리하게 작용했을 가능성이 있다. 이러한 결과는 생존율 감소와 첨체반응률 증가가 서로 독립적인 현상이라기보다 저장 과정에서 발생한 정자막 손상의 서로 다른 결과임을 시사한다.
Fig. 2
Sperm acrosome reaction of goat semen diluted with Modena B or Triladyl, with or without seminal plasma, during liquid storage at 4°C or 17°C. Representative flow cytometric dot plots of sperm stained with fluorescein isothiocyanate- conjugated peanut agglutinin (FITC-PNA) and propidium iodide (PI) at 0, 72, and 120 hours of storage (A). Sperm acrosome reaction at 0 hour (B), 72 hours (C), and 120 hours (D) of storage. Data are presented as mean ± SEM (n = 4). Statistical analyses were performed separately at each time point using one-way ANOVA and Student's t-test. a,b Different lowercase letters indicate significant differences among extender/seminal plasma groups within the same storage temperature (p < 0.05). Asterisk (*) indicates significant differences between storage temperature treatments within the same extender and seminal plasma condition (p < 0.05). NS: without seminal plasma, S: with seminal plasma, M: Modena B, and Tr: Triladyl.
본 연구 결과는 저장온도의 효과가 희석액 조성과의 상호작용에 따라 달라질 수 있음을 보여주었다. 따라서 염소 정자의 액상보존에서는 저장온도를 단독으로 고려하기보다 희석액 조성과 함께 최적화하는 접근이 필요하며, 본 연구 결과는 Modena B가 17°C 액상보존 조건에서 정자 생존성과 첨체 안정성을 보다 효과적으로 유지할 수 있는 희석액임을 시사한다. 다만 본 연구에서는 저장성 변화와 관련된 기능적 지표를 중심으로 평가하였으므로, 향후에는 정자막 손상과 관련된 분자적 기전을 함께 분석하여 희석액 조성과 저장온도의 상호작용을 보다 명확히 규명할 필요가 있을 것으로 생각된다.
4. Conclusion
본 연구는 염소 정액의 액상보존 과정에서 희석액(Modena B, Triladyl), 정장물질 유무 및 저장 온도(4°C, 17°C) 가 정자의 생존율과 첨체반응률에 미치는 영향을 평가하기 위해 수행되었다. 그 결과 Modena B 처리구는 저장 기간과 온도에 관계없이 안정적으로 높은 생존율과 낮은 첨체반응률을 유지한 반면, Triladyl 처리구는 17°C에서 저장 72시간 이후 유의적으로 급격한 생존율 감소와 첨체반응률 증가를 나타내었다(p < 0.05). 이는 저장온도의 효과가 희석액 조성과의 상호작용에 따라 달라질 수 있음을 보여준다. 결론적으로, 본 연구에서 사용한 Modena B는 17°C 액상보존 조건에서 Triladyl보다 우수한 정자 저장성을 나타내었으며, 염소 정자의 액상보존 조건을 설정할 때에는 저장온도와 희석액 조성을 함께 고려하는 것이 중요함을 시사한다. 다만, 향후에는 정자 미토콘드리아 활성 및 활성산소종 수준과 같은 추가적인 기능 지표를 평가하고, 체외수정 또는 인공수정을 통한 수태율 검증을 수행하여 실제 현장 적용 가능성을 확인할 필요가 있을 것으로 생각된다.
