1. Introduction
2. Materials and Methods
2.1. 2D 배양
2.2. 사과 섬유질의 추출
2.3. 3D 배양을 위한 배지 조성
2.4. 호르몬 및 성장인자 처리
2.5. 종양의 크기 분석
2.6. Phalloidin 염색 및 형광 분석
2.7. 통계 분석
3. Results
3.1. TME의 환경 조건에 따른 종양세포의 형태학적 비교
3.2. 3D 배양배지 조건에 따라 종양세포에서 발생하는 phalloidin에 따른 형태학적 변화 분석
4. Discussion
5. Conclusions
1. Introduction
대장암은 전 세계에서 가장 흔한 암 중 하나이며, 암 관련 사망률에서 두 번째로 높은 치사율을 보인다[1]. 초기 진단 시 치료 효율이 90%에 달하지만, 질환이 진행되거나 전이성으로 발전할 경우 생존율이 약 15%로 급격히 감소한다[2]. 대장암의 주요 전이 경로는 체순환계를 통해 이루어지며, 가장 흔한 전이 부위는 간으로 알려져 있다[3]. 이에 따라 대장암과 관련된 사망의 대부분은 원발성 종양 자체보다 전이로 인한 것으로 추정된다[4].
현재 전이성 대장암 치료에는 수술, 화학요법, 표적 요법 및 면역요법이 주로 사용되며, 최근에는 암세포의 대사 과정을 교란하거나 대사를 저해하는 새로운 치료 전략이 연구되고 있다[5]. 그러나 대장암 세포는 면역세포를 교란하는 다양한 면역 억제 기전을 보유하고 있으며, 세포 간 접촉 및 paracrine signaling을 활용하여 전이율을 증가시키는 것으로 알려져 있다[6, 7]. 그러나 이러한 과정의 분자적 기전은 아직 충분히 규명되지 않았으며, 대장암 세포 간의 상호작용을 이해하는 것이 치료 전략 개발에 필수적인 요소이다[8].
대장암 종양 세포의 면역 기전을 연구하기 위해서는 암세포의 발생 과정에서 표현형 및 기능 조절 기전을 분석해야 한다. 이를 위해 종양의 미세 환경(TME)을 모방할 수 있는 체외 모델이 필요하지만, 원발성 및 전이성 대장암에서 종양-기질 세포 상호작용을 재현할 수 있는 체외 배양 모델이 여전히 부족한 실정이다[9]. 기존의 2D 공동 배양 시스템은 접근성이 높고 비용이 낮다는 장점이 있지만, TME 내에서 세포의 형태 변화, 극성(polarization), 종양 복잡성 및 이질성을 충분히 반영하기 어렵다[10]. 따라서 CRC TME 내 특정 표현형에 대한 개별 기여도를 평가할 수 있는 임상적 및 생리학적으로 적절한 배양 시스템의 개발이 필요하다[11].
이러한 한계를 극복하기 위해 최근에는 스페로이드(spheroid) 및 오가노이드(organoid) 기반 3D 공동 배양 모델이 연구되고 있다[12]. 이러한 모델은 기존 2D 배양의 단점을 보완하고, 종양세포와 정상 세포 간의 복잡한 상호작용을 보다 효과적으로 재현할 수 있는 유망한 도구로 평가된다[13]. 현재까지 다양한 종양에 대한 스페로이드 기반 TME 모델이 개발되었지만, 대장암의 주요 특징인 종양 이질성(tumor heterogeneity), 선분화(glandular differentiation), 그리고 극성(polarization)을 완전히 반영하지 못하며, 높은 비용도 문제로 지적된다[1, 14].
대장암 세포의 자기 조직화 능력을 연구하고 자연적인 종양 환경을 재현하기 위해서는 세포가 스스로 분화할 수 있는 적절한 환경을 제공해야 한다. 이에 본 연구에서는 콜라겐 매트릭스(collagen matrix)를 이용하여 종양 미세 환경(TME)을 조절함으로써, 기존 2D 배양 시스템과 유사한 방법으로 3D 배양 형태를 구현할 수 있는지를 분석하였다
2. Materials and Methods
2.1. 2D 배양
본 연구에서는 HCT116 대장암 세포주를 사용하여 3D 배양 시스템을 구축하였다. 세포 배양을 위한 기본 배지는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)의 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)을 사용하였으며, 여기에 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1% Penicillin/Streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 그리고 1% 항생제 용액을 첨가하였다. 세포는 37°C, 5% CO₂가 포함된 습윤 배양기에서 배양하였으며, 모든 실험에서 동일한 조건을 유지하였다.
2.2. 사과 섬유질의 추출
사과에서 식이 섬유질을 추출하기 위해 효소 및 물리적 처리를 병행하는 방법을 적용하였다. 먼저, 신선한 사과를 깨끗이 세척한 후 껍질을 제거하고 작은 조각으로 분쇄하였다. 이후, 분쇄된 사과를 95°C에서 30분간 α-아밀라아제(α-amylase, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 처리하여 전분을 가수분해하였다. 그 후, 단백질을 제거하기 위해 55°C에서 1시간 동안 단백질분해효소(protease, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 처리하였다. 효소 처리가 끝난 후, 원심분리기(10,000 rpm, 15분)를 이용하여 상층액을 제거하였으며, 잔여 물질을 증류수로 세척한 후 75% 에탄올을 이용하여 당 성분을 제거하였다. 마지막으로, 건조기에서 50°C로 건조한 후 미세한 가루로 분쇄하여 사과 유래 식이 섬유질을 확보하였다. 추출된 식이 섬유질은 –20°C에서 보관하며 실험에 사용하였다.
2.3. 3D 배양을 위한 배지 조성
본 연구에서는 콜라겐 매트릭스를 이용한 3D 배양 시스템을 구축하기 위해 네 가지 유형(Type)의 배양 배지를 조성하였다.
Type 1 배지는 DMEM/Ham’s F-12 배지(9.9 mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 콜라겐 Type I (500 µL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 콜라겐 Type II (500 µL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1% 젤라틴(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 15% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin을 혼합하여 제조하였다.
Type 2 배지는 Type 1 배지에 0.001% Mg²⁺ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.001% Ca²⁺ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.05N NaOH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 추가하여 조성하였다.
Type 3 배지는 Type 2 배지에 1% glucose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 추가하여 제조하였다.
Type 4 배지는 Type 3 배지에 사과에서 추출한 식물성 섬유질 1 µg을 첨가하여 구성하였다.
각 배지는 실험 전 0.22 µm 필터(Millipore, Burlington, MA, USA)로 멸균 처리한 후 신선하게 준비하여 사용하였다.
2.4. 호르몬 및 성장인자 처리
각 배양 조건에서는 17β-에스트라디올(17β-estradiol, Cat No. E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 상피세포 성장인자(EGF, Cat No. E9644, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 실험을 진행하였다. 17β-에스트라디올은 최종 농도 10⁻⁸ M, EGF는 0.01 ng/mL가 되도록 처리하였다. 배양접시는 Non-courting 12-well plate (Corning, Corning, NY, USA)를 사용하여 세포가 플라스틱 표면에 부착되지 않도록 하였으며, 3D 환경에서 세포 간 응집이 자연스럽게 일어날 수 있도록 유도하였다(Fig. 1A).
2.5. 종양의 크기 분석
각 3D 배양배지에서 형성된 종양의 크기를 측정하기 위하여 광학현미경(Nikon Eclipse Ni-2, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 종양의 형태학적 분석을 하였으며, 이후 ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 사용하여 종양의 크기를 비교 분석하였다.
2.6. Phalloidin 염색 및 형광 분석
세포골격 구조 분석을 위해 Phalloidin 염색을 수행하였다. 배양이 끝난 세포는 PBS로 세척한 후 4% PFA (paraformaldehyde, Cat No. P6148, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 15분간 고정하였다. 이후, 0.1% Triton X-100 (Cat No. T9284, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 5분간 세포 투과화 처리를 하였다. Phalloidin-iFluor 488 Reagent (Cat No. AAT-23114, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 제조사의 프로토콜에 따라 희석하여 실온에서 30분간 염색하였다. 염색이 완료된 세포는 형광 현미경(Nikon Eclipse Ni-2, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 488 nm 파장에서 형광 신호를 검출하였으며, ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하였다.
2.7. 통계 분석
모든 실험 결과는 SPSS 통계 소프트웨어(IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA)를 이용하여 분석하였다. 데이터 분석은 General Linear Model (GLM) 분석 방법을 적용하였으며, 통계적 유의성은 p < 0.05 수준에서 검정하였다.
3. Results
3.1. TME의 환경 조건에 따른 종양세포의 형태학적 비교
일반세포 배양과 종양의 형태로 발생을 유도한 모델하기 위하여 호르몬 및 성장인자의 투여가 종양체로의 분화 작용에 영향을 미치는지를 분석한 결과는 Fig. 2와 같다. 대장암 세포를 3D 콜라겐 배지에서 배양하여 종양 구조 형성을 분석한 결과, 배지의 조성과 호르몬 첨가 여부에 따라 종양의 성장과 형태가 명확히 달라지는 양상이 확인된다(Fig. 1B, Fig. 2). 호르몬이 첨가되지 않은 조건에서, 콜라겐만 포함된 Type 1 배지에서는 세포가 미미한 응집을 보이며 종양 구조가 거의 형성되지 않고, 종양 크기 또한 크게 증가하지 않는다. Mg²⁺, Ca²⁺, NaOH가 추가된 Type 2 배지에서는 세포 응집이 증가하며 비교적 더 명확한 구조가 관찰되고, 종양 크기 또한 Type 1보다 커지는 경향을 보인다. 포도당이 추가된 Type 3 배지에서는 종양 크기가 현저히 증가하며, 세포 구조가 더욱 조밀하고 뚜렷하게 형성된다. 여기에 식물성 섬유질이 포함된 Type 4 배지에서는 가장 큰 종양 구조와 조밀한 세포 응집이 관찰되며, 배양 기간 동안의 성장률도 가장 높게 나타난다. 호르몬(EGF와 β-estradiol)을 첨가한 배지에서는 모든 조건에서 종양 성장이 가속화되며, 특히 Type 4 배지에서 가장 빠르고 현저한 성장이 확인된다. 성장 곡선 분석 결과, 호르몬 첨가가 종양 크기 증가를 촉진하는 주요 요인으로 작용하며, 식물성 섬유질의 추가는 호르몬과 상호작용하여 종양 성장과 구조 형성에 시너지 효과를 나타내는 것이 확인된다. 이와 같은 결과는 배지의 구성 성분과 미세 환경 조성이 종양 형성과 성장에 중요한 영향을 미친다는 것을 보여준다.
Fig. 2.
Analysis of morphological changes in tumor cells in each culture medium after 8 days of culture in 3D medium without hormones and 3D culture medium supplemented with 17β-estradiol and EGF. *Different letters within the same column represent significant differences (p < 0.05). Magnification 100X, Size bar: 100 um.
3.2. 3D 배양배지 조건에 따라 종양세포에서 발생하는 phalloidin에 따른 형태학적 변화 분석
대장암 세포를 3D 콜라겐 기반 배지에서 배양하고 phalloidin 발현을 분석한 결과, 배지 조성과 호르몬(EGF와 β-estradiol) 첨가 여부가 세포골격의 재구성과 종양 형태 형성에 중요한 영향을 미치는 것으로 나타났다(Fig. 3A). Type 1 배지에서 호르몬이 첨가되지 않은 경우 phalloidin 발현이 낮고 세포 구조의 조직화가 미미하였으나, 호르몬을 첨가했을 때 미세섬유가 강화되고 세포 간 결합이 뚜렷하게 나타났다. 또한, Type 3과 Type 4 배지에서는 호르몬 첨가 여부에 따라 phalloidin 발현과 세포골격 강화가 더욱 두드러졌으며, 특히 Type 4 배지에서는 식물성 섬유질의 추가로 인해 호르몬 비첨가 조건에서도 높은 수준의 phalloidin 발현과 안정적인 세포 조직화가 관찰되었다. Type 4 배지에 호르몬을 첨가한 경우, 가장 강력한 phalloidin 발현과 함께 세포골격 구조가 뚜렷하게 강화되고 종양 형태가 조밀하고 안정적으로 형성되었으며, 이는 식물성 섬유질과 호르몬이 시너지 효과를 통해 종양 성장과 세포골격 재구성에 강력하게 기여함을 보여준다(Fig. 3B). 이러한 결과는 배지의 구성 성분과 호르몬 신호가 세포골격의 조직화 및 종양 구조 형성에 미치는 중요한 영향을 강조한다.
Fig. 3.
Comparison of the distribution and morphological differences of phalloidin in tumor cells in the final selection 3D culture medium that formed tumor morphology and the culture medium supplemented with hormones. A: Comparison of differences according to the addition of 17β-estradiol and EGF in 3D Type 1 culture medium. B: Comparison of differences according to the addition of 17β-estradiol and EGF in Type 3 and Type 4 culture media that are the best for tumor development. Magnification 100X, Size bar: 100 um.
4. Discussion
본 연구에서는 대장암 세포를 3D 콜라겐 기반 배지에서 배양하고, 배지 조성과 호르몬(EGF와 β-estradiol) 첨가 여부에 따른 종양 구조 형성과 phalloidin 발현을 분석하였다. 결과는 배지 구성과 호르몬 신호가 세포골격 재구성과 종양 형태 형성에 중요한 영향을 미친다는 것을 보여준다. 특히, Type 4 배지에서 식물성 섬유질과 호르몬의 결합이 phalloidin 발현을 극대화하고 세포골격 구조를 강화하여 조밀한 종양 형태를 형성한 점은 본 연구의 주요 차별성을 나타낸다.
3D 콜라겐 기반 배지가 암세포의 자연스러운 성장 환경을 재현한다는 점은 기존 연구에서도 보고된 바 있다[15, 16]. 그러나 기존 연구는 주로 ECM의 일반적인 효과에 초점을 맞춘 반면, 본 연구는 ECM의 조성과 호르몬 신호의 상호작용을 심층적으로 분석하였다. 이는 세포골격의 강화와 구조적 안정성에 ECM 조성과 호르몬이 동시에 미치는 영향을 규명했다는 점에서 기존 연구와 차별화된다[13].
EGF와 β-estradiol의 첨가가 세포골격 재구성과 종양 형성을 강화한다는 결과는 Normanno et al. [17] 및 Acconcia et al. [18]의 연구와 일치한다. 특히, EGF는 암세포의 증식과 생존 신호를 촉진하며, β-estradiol은 암세포의 구조적 조직화와 분화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 이러한 효과를 Type 3 및 Type 4 배지에서 확인함으로써, 복합적인 미세 환경이 세포골격에 미치는 영향을 구체적으로 제시하였다.
식물성 섬유질의 역할에 대해서는 기존 연구에서 암세포 성장 억제 효과가 주로 강조되었다[3, 4]. 그러나 본 연구는 식물성 섬유질이 특정 조건에서 암세포의 세포골격 안정성과 조직화를 강화하는 데 기여할 수 있음을 보여주었다. 이는 식물성 섬유질이 미세 환경을 조절하여 암세포의 구조적 안정성을 높이는 잠재적 메커니즘을 시사한다. 특히 Type 4 배지에서 호르몬과 식물성 섬유질이 결합된 조건은 종양 조직화와 세포골격 강화가 가장 뚜렷하게 관찰되어, 기존 연구에서 다루지 않았던 새로운 기전을 제안한다.
한편, 최근 발표된 연구들은 3D 배양 시스템이 암세포의 이동성과 침습성을 증가시키며, ECM (Extracellular matrix)의 조성과 호르몬 신호가 이에 결정적인 역할을 한다고 보고하였다[19, 20]. 또한, Kim et al. [12]는 3D 배양 시스템이 2D 배양과 비교해 암세포의 생물학적 특성을 더 효과적으로 모사한다고 보고하며, 3D 환경에서 ECM과 신호 분자가 암세포의 행동에 미치는 복합적 영향을 강조하였다. 본 연구 결과는 이러한 연구들과 일치하며, ECM 조성과 호르몬이 세포골격 및 종양 구조에 미치는 복합적인 영향을 더욱 구체적으로 증명하였다. 본 연구를 통하여 추후 동물 실험을 통하여 종양체의 기능을 연구함으로써 종양세포의 3D 배양 체계에 대한 새로운 방법을 제안할 수 있을 것이라 사료된다.
